NGS Core
(Core-Facility „Omics“)

Prof. Dr. Michael Rehli

 

Der “Next Generation Sequencing” Core des RCI (kurz: RCI NGS Core) ermöglicht Forschern des RCI, des Universitätsklinikums und der Universität Regensburg (in Zusammenarbeit mit der Genomics Core Unit der Universität Regensburg) den einfachen und schnellen Zugang zu neusten Sequen-zierungstechnologien. Unser Methodenspektrum umfasst Analysen der Genexpression, von Genom-sequenzen, Immunzellrezeptorrepertoirs, Chromatinstrukturen und epigenetischer Modifikationen, sowohl auf der Ebene von Zellpopulationen als auch z.T. auf Einzelzellebene.

Zusätzlich zu unserem Sequenzierungsservice bieten wir Hilfe bei der Planung von NGS-Experimenten und (in Zusammenarbeit mit der Computational Core Unit der Universität Regensburg) bei der bioinformatischen Aufbereitung und Auswertung der generierten Daten.

NEWS

NGS-SERVICE (Illumina NextSeq 550)

Allgemeines

Wir sind eine akademische Sequenzierungseinheit und stellen eine breite Palette an NGS-Methoden zur Verfügung. Als Partner der Computational Core Unit (CCU) der Universität Regensburg bieten wir auch Unterstützung bei bioinformatischen Analysen.

Wenn Sie diesen Service zum ersten Mal nutzen besprechen Sie bitte ihre geplanten Experimente vorab mit uns. Sollten Sie generelle Fragen zum Ablauf haben, melden sie sich bei uns. (Kontakt: genomics-core(at)rcii.de).

Voraussetzungen für die Nutzung des NGS-Service

  • Der Sequenzierungsservice wird nur für Forschungszwecke bereitgestellt ohne Garantien oder Haftung.
  • Die anfallenden Kosten für Probenpräparation, Librarypräparation und Sequenzierung trägt die beauftragende Institution, bzw. der Arbeitsgruppenleiter
  • Proben und Sequencing Libraries dürfen nur zur Prozessierung an den RCI NGS Core übergeben werden, wenn die rechtlichen Grundlagen zur genomischen Analyse erfüllt sind (gültiges Ethikvotum/ genehmigter Tierversuchsantrag/ DS-GVO-konforme Patienteneinwilligung).
  • Der Auftraggeber stellt ein Sample Sheet zur Verfügung.
  • Bei der Publikation der Sequenzierdaten muss die Leistung des RCI NGS Core in der Danksagung entsprechend anerkannt werden (z.B: „Sequencing was conducted at the NGS Core Unit of the Regensburg Center for Interventional Immunology (RCI, University Regensburg and University Medical Center Regensburg, Germany))“

Weitere Nutzungsbedingungen siehe Allgemeine Geschäftsbedingungen.

Vorbereitung der Sequenzierung

NextSeq 550:

  • Flow Cells:
    Alle Nutzer müssen die benötigten Flow Cells für den NextSeq 550 (Illumina) selbst beschaffen und lagern sie selbst (nicht-RCI Mitglieder) oder beim RCI NGS Core (RCI Mitglieder). Hinweise zur Beschaffung und Lagerung finden sie hier: FlowCell-Beschaffung).

  • Termin für den Sequenzierlauf:
    Bitte suchen sie einen passenden, freien Termin im NextSeq550 Kalender und schicken ihren Terminvorschlag an genomics-core(at)rcii.de.

    • Buchungsformular:
      Wenn der NextSeq550 Termin bestätigt ist, füllen Sie bitte ein Buchungsformular aus: BookingNextSeq_Form.pdf (digital ausfüllbar) und senden sie es vorab an genomics-core(at)rcii.de.

    • Zusätzlich bringen sie das ausgefüllte und vom PI unterschriebene Buchungsformular spätestens am Tag der Sequenzierung zum NGS Core.

  • Sample Sheet:
    Bereiten Sie bitte ein Samplesheet vor (Illumina Experiment Manager) schicken dies an genomics-core(at)rcii.de.

Wenn Sie neu sind besprechen Sie bitte mit uns welche Flowcell-Spezifikation Sie für Ihre Experimente und unser Gerät benötigen. (Kontakt: genomics-core(at)rcii.de)

Durchführung der Sequenzierung

Bringen sie bitte die Sequencing Library mit einer Konzentration von 4 nM (optimal). Geringere Konzentrationen sind zwar generell möglich (0,5 bis 4 nM) führen aber generell zu einer verringerten Clusterdichte.

Wir sequenzieren ihre Proben nur, wenn das vom PI unterschriebene Buchungsformular vorliegt!

Datentransfer

Nach Rücksprache übermitteln wir ihnen die Daten im gewünschten Format (Festplatte oder Transfer auf Server).

Bei Fragen schreiben Sie bitte jeder Zeit an genomics-core(at)rcii.de.

KOLLABORATIONSPROJEKTE

Allgemeines

Zusätzlich zum reinen Sequenzierungsservice haben wir im Rahmen wissenschaftlicher Kollaborationen (innerhalb und außerhalb des RCI) auch die Möglichkeit Proben für die Sequenzierung vorzubereiten.

Wir übernehmen je nach Kapazität und Bedarf die Extraktion von Nukleinsäuren, die Präparation von Sequencing Libraries, die Quantifizierung und die bioinformatische Analyse (s. Generelle Informationen/Methoden).

Anfragen richten sie bitte an genomics-core(at)rcii.de

Voraussetzungen für die Durchführung von Kollaborationsprojekten

Kollaborationspartner verpflichten sich dazu:

  • Die Experimente sowie deren statistische/bioinformatische Analysen mit dem verantwortlichen Personal der RCI NGS Core Facility vorab zu besprechen, damit das Projekt die größte Aussicht auf Erfolg hat.

  • Der RCI NGS Core Leiter (Michael Rehli) muss vor dem Einreichen von Publikationen, die sich aus Kollaborationsprojekten ergeben, informiert werden (email: Titel, Autorenliste und Abstract). Je nach Beteiligung wird das RCI NGS Core durch Koautorenschaften an der Publikation beteiligt, oder zumindest in der Danksagung erwähnt. (z.B: „Sequencing was conducted at the NGS Core Unit of the Regensburg Center for Interventional Immunology (RCI, University Regensburg and University Medical Center Regensburg, Germany)“).

Weitere Nutzungsbedingungen siehe Allgemeine Geschäftsbedingungen.

Probenübergabe

Vor der Übergabe von Proben lesen Sie bitte die Hinweise unter Material und NGS-SERVICE. Anschließend kontaktieren Sie uns bitte per email ( genomics-core(at)rcii.de), um einen Termin für die Übergabe der Proben und des unterschriebenen Buchungsformulars zu vereinbaren. Wenn Sie Fragen zum experimentellen Design haben, zum ersten Mal die Sequenzierung nutzen wollen oder eine komplizierte Fragestellung haben, bitten Sie einfach um einen längeren Gesprächstermin.

 

DOKUMENTE:

PROBENBESCHRIFTUNG:

Die Proben müssen leserlich und eindeutig mit einem wasserfesten Stift beschriftet werden. Als Bezeichnungen sollten einfache Buchstaben-Zahlen-Kombinationen gewählt werden. In Kooperationsprojekten bitte die Projektnummer PR###-Probennummer angeben.

PROBENMATERIAL:

Nukleinsäure Bibliotheken (NGS Libraries):

  • 4 nM (optimal)
  • 0,5 bis 4 nM (möglich)

Zellen: in RLT Puffer, N2-Pellet, Crosslinked N2-Pellet,…

  • multiwell-plates oder tubes
  • S1 Material kann jederzeit bearbeitet werden, S2 Material wird nur nach vorheriger Absprache angenommen.

Nukleinsäuren:

  • DNA: 10 ng - 1000 ng
  • RNA: 10 pg - 1000 ng

AUSSTATTUNG

Next Generation Sequencing

NextSeq 550 (Illumina) Hochdurchsatz Sequenzierung

  • Sequenzierung 15-26h
  • 1x75 bp : 10 Mio reads, 40 Proben 11 h (single-end, high output flowcell)
  • 2x75 bp: 25 Mio reads, 16 Proben 18 h (paired-end, high output flowcell)
  • 2x150 bp: (paired-end, mid and high output flowcell)
  • Hochdurchsatz Sequenzierung von großen Projekten führen wir aus Kostengründen z.T. extern durch. Längere Reads können bei Bedarf in Kooperation mit dem Lehrstuhl Biochemie I auf deren MiSeq (Illumina) durchgeführt werden.

Einzelzellanalyse

  • Chromium System (10x Genomics) Barcoding von Einzelnen Zellen oder Zellkernen zur Analyse der Genexpression, von T-Zellrezeptorrepertoires oder offenem Chromatin.
  • „combinatorial Indexing“: (geplant)

Quantifizierung und Qualitätskontrolle

  • Tapestation 2200/4150 (Agilent): automatisierte Gelelektrophorese in einem „Microfluidic device“. Quantifizierung und Längenmessung von Nukleinsäuren
  • Qubit Fluorometer (ThermoFischer Scientific): Fluoreszenz-basierte, exakte Messung von RNA, DNA und Proteinen
  • KAPA Library Quant Kits (Roche)

Weitere Analysensysteme und Geräte

MassARRAY System

  • SNP-Analyse (iplex)
  • DNA-Methylierungsanalyse (Epityper)

 

 

 

 

 


Nukleinsäuren Fragmentierung

  • Covaris S220 Focused-ultrasonicator
  • Branson SONIFIER 250

Transfektion

  • Neon Elektroporator (geringe Zellzahl)
  • Biorad Elektroporator (mittlere bis hohe Zellzahl)
  • Amaxa

METHODENSPEKTRUM

Extraktion von Nukleinsäuren

DNA/RNA: Nukleinsäuren Adsorption basierte Kit Systeme

Präparation von Nukleinsäurebibliotheken (Library Prep)

Sequenzierung des Immunrepertoires von T-Zellen:

  • T-Zellpopulation
  • Einzelzellen (10x Genomics)

Sequenzierung von Transkriptomen:

  • strangspezifische Gesamt RNA-seq (Input 100ng -1000ng RNA)
  • strangspezifische Gesamt RNA-seq für geringe Zellzahl (Input 1 bis 1000 Zellen/10 pg bis 10 ng RNA)
  • strangspezifische mRNA-seq(poly-A Anreicherung) (Input 100ng -1000ng RNA)
  • strangspezifische mRNA Bibliothek für geringe Zellzahl (Input 1 bis 1000 Zellen/10 pg bis 10 ng RNA)
  • Einzelzellen RNA-seq: 10x Genomics
  • Einzelzellen RNA-seq + TCR: 10x Genomics

Sequenzierung von Genomen:

  • gesamt Genom Sequenzierung (WGS)
  • zielgerichte Genom Sequenzierung (Exom, benutzerdefiniert)
  • gerichtete SNP Analyse (iPlex) (Bis zu 24 SNPs in 384 Proben pro Lauf)

Kartierung von epigenetischen Eigenschaften oder Faktoren:

  • Chromatinstruktur (ATAC)
  • Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren (ChIP)
  • DNA Methylierung (MCIp, Bisulfit-Sequenzierung)
  • 3D-Kernstruktur (HiC, HiChIP)

MassARRAY System (384 Zielsequenzen pro Lauf)

  • DNA-Methylierungsanalysen mittels Epityper
  • SNP-Analysen mittels iPlex

PREISE

in Vorbereitung

Informationen

RCI NGS Core Team

Prof. Dr. Michael Rehli (Leiter): +49 941 944-38187
Dr. Claudia Gebhard (Laborleiterin): +49 941 944-18186
Dr. Nicholas Strieder (Bioinformatik): +49 941 944-18188
Johanna Raithel (TA): +49 941 944-18189

UKR assoziierte Mitarbeiter:
Ute Ackermann
Margit Nützel
Hanna Stanewsky

Publikationen

Delacher M, Imbusch CD, Hotz-Wagenblatt A, Mallm JP4, Bauer K, Simon M, Riegel D, Rendeiro AF, Bittner S, Sanderink L, Pant A, Schmidleithner L, Braband KL, Echtenachter B, Fischer A, Giunchiglia V, Hoffmann P, Edinger M, Bock C, Rehli M, Brors B, Schmidl C, Feuerer M. (2020). Precursors for Nonlymphoid-Tissue Treg Cells Reside in Secondary Lymphoid Organs and Are Programmed by the Transcription Factor BATF. Immunity S1074-7613(19)30498-4

Minderjahn J, Schmidt A, Fuchs A, Schill R, Raithel J, Babina M, Schmidl C, Gebhard C, Schmidhofer S, Mendes K, Ratermann A, Glatz D, Nuetzel M, Edinger M, Hoffman P, Spang R, Laengst G, Imhof A & Rehli M. (2020). Mechanisms governing the pioneering and redistribution capabilities of the non-classical pioneer PU.1. Nat Commun 11:402

Delacher M, Schmidl C, Herzig Y, Breloer M, Hartmann W, Brunk F, Kägebein D, Träger U, Hofer AC, Bittner S, Weichenhan D, Imbusch CD, Hotz-Wagenblatt A, Hielscher T, Breiling A, Federico G, Gröne HJ, Schmid RM, Rehli M, Abramson J, Feuerer M. (2019). Rbpj expression in regulatory T cells is critical for restraining TH2 responses. Nat Commun 10(1):1621

Kappelmann-Fenzl M, Gebhard C, Matthies AO, Kuphal S, Rehli M, Bosserhoff AK. (2019). C-Jun drives melanoma progression in PTEN wild type melanoma cells. Cell Death Dis. 0(8):584

Gebhard C, Glatz D, Schwarzfischer L, Wimmer J, Stasik S, Nuetzel M, Heudobler D, Andreesen R, Ehninger G, Thiede C, Rehli M. (2019). Profiling of aberrant DNA methylation in acute myeloid leukemia reveals subclasses of CG-rich regions with epigenetic or genetic association. Leukemia 33:26-36

Vatter S, Schmid M, Gebhard C, Mirbeth C, Klobuch S, Rehli M, Herr W, Thomas S. (2018). In-vitro blockade of the CD4 receptor co-signal in antigen-specific T-cell stimulation cultures induces the outgrowth of potent CD4 independent T-cell effectors. J Immunol Methods. 454:80-85

FAQ

Wie soll ich den RCI NGS Core in der Danksagung erwähnen:

Bei Sequenzierungsservice:

„Sequencing was conducted at the NGS Core Unit of the Regensburg Center for Interventional Immunology (RCI, University Regensburg and University Medical Center Regensburg, Germany)“

Bei Kollaborationsprojekten:

Autorenliste entsprechend der Beteiligung am Projekt, bitte email an: Michael.Rehli(at)ukr.de

Kontakt

Ansprechpartner:

Prof. Dr. Michael Rehli: +49 941 944-38187

Dr. Claudia Gebhard: +49 941 0944-18186

Dr. Nicholas Strieder: +49 941 944-18188

Adresse:

RCI NGS Core

Forschungsbau: D5

Innere Medizin III/RCI

Franz-Josef-Strauß Allee 11

93053 Regensburg

Universitätsklinikum Regensburg

Telefon: +49 941 944-38187

Allgemeine Geschäftsbedingungen

Die anfallenden Kosten für Probenpräparation, Library Präparation und Sequenzierung trägt die beauftragende Institution, repräsentiert durch den Arbeitsgruppenleiter*.

Der Auftraggeber* verpflichtet sich die nachstehenden Regelungen zu beachten und einzuhalten:

  • Der Auftraggeber* darf nur Proben und Sequencing Libraries zur Prozessierung an den RCI NGS Core übergeben, für die er/sie auch die rechtliche Grundlage zur genomischen Analyse besitzt. D.h. für die Proben oder Sequencing Libraries muss ein gültiges Ethikvotum oder ein genehmigter Tierversuchsantrag vorliegen, im Fall von humanen primären Zellen/Gewebe muss eine Patienteneinwilligung eingeholt werden. Alle Proben müssen pseudonymisiert sein. Für die Einhaltung der Vorschriften der IT Sicherheit und des Datenschutzes innerhalb eines wissenschaftlichen Projektes ist der jeweilige Projektleiter verantwortlich. (Einverständniserklärung des Patienten, Ethikvotum, Freigabe durch die Institution des Kollaborationspartners etc.). Für Teilbereiche kann diese Verantwortung delegiert werden. Die Voraussetzungen zur Delegation sind entweder institutionell gegeben, oder sind durch entsprechende Maßnahmen (s. „Instrument“ in der Tabelle) zu schaffen. Teilverantwortung übernehmen die folgenden Einheiten (siehe Tabelle).

  • Der RCI NGS Core bemüht sich qualitativ hochwertige Daten zu liefern, verpflichtet sich jedoch nicht ein Minimum an “reads” oder “quality scores” einzuhalten, da diese Werte vom zur Verfügung gestellten Material abhängen. Technische Fehler die allein von Mitarbeitern des RCI NGS Core zu verantworten sind, führen zur kostenlosen Wiederholung des entsprechenden Arbeitsschrittes. Fehlerhafte Analysen, die vorwiegend auf die Qualität des Ausgangsmaterials zurückzuführen sind, werden dem Auftraggeber in Rechnung gestellt.

  • Die Kosten für Kollaborationsprojekte werden vom RCI subventioniert. Um gewährleisten zu können, dass diese Subventionierung sachgemäß und möglichst erfolgreich eingesetzt wird, entstehen beim Kollaborationspartner bestimmte Pflichten:

  1. Das experimentelle Design muss so gewählt werden, dass das Experiment die größtmögliche Aussicht auf Erfolg hat. Daher muss ein Beschreibung des Experiments mit der wissenschaftlichen Fragestellung und ein Vorschlag zur statistischen/bioinformatischen Analyse vorgelegt und mit den verantwortlichen Mitarbeitern des RCI NGS Core besprochen werden.

  2. Der Auftraggeber stellt ein Sample Sheet mit detaillierter Darstellung der verwendeten Protokolle der Probenherstellung zur Verfügung, um die Sequenzierung, Datenverarbeitung oder -übertragung und etwaige Fehlersuche zu erleichtern.

  3. Der RCI NGS Core Leiter (Michael Rehli) muss vor dem Einreichen von Publikationen von Kollaborationsprojekten (email: Titel, Autorenliste und Abstract) informiert werden. Weiterhin muss der RCI NGS Core in der Danksagung aufgeführt werden (z.B.: „Sequencing was conducted at the NGS Core Unit of the Regensburg Center for Interventional Immunology (RCI, University Regensburg and University Medical Center Regensburg, Germany)“).

  • Der Sequenzierungsservice wird nur für Forschungszwecke bereitgestellt ohne Garantien oder Haftung.

  • Die bereitgestellten Proben bleiben Eigentum des Auftraggebers. Der RCI NGS Core garantiert eine Lagerung der Proben von drei Monaten. Nach der Analyse verbliebene Probenmengen können an den Auftraggeber zurückgegeben werden.

  • Sequenzierungsdaten werden dem Auftraggeber in einem geeigneten Format übermittelt. Die Sequenzierungsdaten werden für maximal drei Monate aufbewahrt und dann gelöscht.

  • Auftraggeber werden für den Schaden an RCI NGS Core Geräten haftbar gemacht, der aus unsachgemäßem oder fahrlässigem Gebrauch oder dem Transfer von jeglicher Schadsoftware entsteht.

  • Die Nichtbeachtung der Allgemeinen Geschäftsbedingungen kann mit zeitlich begrenztem oder unbegrenztem Ausschluss vom RCI NGS Core geahndet werden.


 

 


 

 

Anfahrt